מוצרים
ערכת גילוי SARS-Cov-2-RT-PCR של Lifecosm עבור 2019-nCoV
שימוש צפוי
ערכה זו משמשת לגילוי איכותני של נגיף קורונה חדש (2019-nCoV) באמצעות דגימות גרון, דגימות אף-לוע, נוזל שטיפה של הסימפונות והאלוואולריות, וליחה. תוצאת הגילוי של מוצר זה היא לצורך התייחסות קלינית בלבד, ואין להשתמש בה כראיה היחידה לאבחון קליני וטיפול. מומלץ לבצע ניתוח מקיף של המצב בשילוב עם הביטויים הקליניים של המטופל ובדיקות מעבדה אחרות.
עקרון הבדיקה
הערכה מבוססת על טכנולוגיית RT-PCR בשלב אחד. למעשה, גני ORF1ab ו-N של נגיף הקורונה החדש משנת 2019 (2019-nCoV) נבחרו כאזורי יעד להגברה. פריימרים ספציפיים וגשושי פלואורסצנטיים (גשושי גן N מסומנים ב-FAM וגשושי ORF1ab מסומנים ב-HEX) נועדו לזהות RNA של נגיף הקורונה מסוג חדש משנת 2019 בדגימות. הערכה כוללת גם מערכת גילוי בקרה פנימית אנדוגנית (גשוש גן בקרה פנימי המסומן ב-CY5) כדי לנטר את תהליך איסוף הדגימות, RNA והגברת PCR, ובכך להפחית תוצאות שליליות שגויות.
רכיבים עיקריים
| רכיבים | כֶּרֶך(48T/ערכה） |
| תמיסת תגובת RT-PCR | 96 מיקרוליטר |
| nCOV primer TaqMan probemix（ORF1ab, N Gene, RNAseP Gene） | 864 מיקרוליטר |
| בקרה שלילית | 1500 מיקרוליטר |
| nCOV שליטה חיובית（l ORF1ab N Gene） | 1500 מיקרוליטר |
ריאגנטים משלכם: ריאגנטים לחילוץ או טיהור RNA. בקרה שלילית/חיובית: הבקרה החיובית היא RNA המכיל את מקטע המטרה, בעוד שהבקרה השלילית היא מים ללא חומצות גרעין. במהלך השימוש, יש להשתתף בחילוץ ויש להתייחס אליהם כאל מדבקים. יש לטפל בהם ולסלק אותם בהתאם לתקנות הרלוונטיות.
גן הייחוס הפנימי הוא הגן RnaseP האנושי.
תנאי אחסון ותאריך תפוגה
-20±5℃, הימנעו מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות יותר מ-5 פעמים, תקף למשך 6 חודשים.
מכשיר רלוונטי
עם FAM / HEX / CY5 ומכשיר PCR פלואורסצנטי רב-ערוצי אחר.
דרישות הדגימה
1. סוגי דגימות רלוונטיים: דגימות גרון, דגימות אף ולוע, נוזל שטיפה ברונכו-אלוואולרית, כיח.
2. איסוף דגימות (טכניקה אספטית)
מבחנה בלוע: נגבו את השקדים ואת דופן הלוע האחורית בעזרת שתי מבחנות בו זמנית, ולאחר מכן טבלו את ראש המבחנה במבחנה המכילה את תמיסת הדגימה.
ליחה: לאחר שהמטופל סובל משיעול עמוק, יש לאסוף את הליחה המשתעלת לתוך מבחנה עם מכסה הברגה המכילה את תמיסת הדגימה; נוזל שטיפת סימפונות-אלוואולרית: דגימה על ידי אנשי מקצוע רפואיים. 3. אחסון והובלת דגימות
יש לבדוק דגימות לבידוד וירוסים ובדיקת RNA בהקדם האפשרי. דגימות שניתן לזהות תוך 24 שעות ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס; אלו שלא ניתן לזהות תוך 24...
יש לאחסן שעות בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס או פחות (אם אין תנאי אחסון של -70 מעלות צלזיוס, יש לאחסן אותן
יש לאחסן באופן זמני במקרר של -20 מעלות צלזיוס). יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של דגימות במהלך ההובלה. יש לשלוח את הדגימות למעבדה בהקדם האפשרי לאחר איסוף הדגימות. אם יש להעביר דגימות למרחקים ארוכים, מומלץ לאחסן אותן בקרח יבש.
שיטות בדיקה
1 עיבוד דגימות ומיצוי RNA (אזור עיבוד דגימות)
מומלץ לקחת 200 מיקרוליטר של דגימה נוזלית לצורך מיצוי RNA. לשלבי מיצוי רלוונטיים, עיינו בהוראות של ערכות מיצוי RNA מסחריות. גם השלילי וגם השלילי
בקרות בערכה זו היו מעורבות בחילוץ.
2 הכנת ריאגנט PCR (אזור הכנת ריאגנט)
2.1 הוציאו את כל הרכיבים מהערכה, הפשירו וערבבו בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ב-8,000 סל"ד למשך מספר שניות לפני השימוש; חשבו את כמות הריאגנטים הנדרשת, והכינו את מערכת התגובה כפי שמוצג בטבלה הבאה:
| רכיבים | מנה N (מערכת 25µl) |
| nCOV primer TaqMan | 18 מיקרוליטר × N |
| תמיסת תגובת RT-PCR | 2 מיקרוליטר × N |
| *N = מספר הדגימות שנבדקו + 1 (ביקורת שלילית) + 1 (nCOVבקרה חיובית) | |
2.2 לאחר ערבוב יסודי של הרכיבים, בצנטריפוגה למשך זמן קצר כדי לאפשר לכל הנוזל שעל דופן המבחנה ליפול לתחתית המבחנה, ולאחר מכן העבירו את מערכת ההגברה של 20 מיקרוליטר למבחנת ה-PCR.
3 דגימה (אזור הכנת דגימה)
הוסיפו 5 מיקרוליטר של בדיקות הביקורת השליליות והחיוביות לאחר החילוץ. ה-RNA של הדגימה לבדיקה מוסיפים למבחנת התגובה של ה-PCR.
סגרו את המבחנה היטב וצנטריפוגה ב-8,000 סל"ד למשך מספר שניות לפני העברתה לאזור גילוי ההגברה.
4 הגברת PCR (אזור גילוי מוגבר)
4.1 הנח את צינור התגובה בתא הדגימה של המכשיר, וקבע את הפרמטרים כדלקמן:
| שָׁלָב | מַחזוֹר מִספָּר | טֶמפֶּרָטוּרָה(°C) | זְמַן | גְבִיָהאֲתַר |
| לַהֲפוֹךתַעֲתוּק | 1 | 42 | 10 דקות | - |
| טרום-דנטורציהn | 1 | 95 | דקה אחת | - |
| מַחזוֹר | 45 | 95 | 15 שניות | - |
| 60 | שנות ה-30 | איסוף נתונים |
בחירת ערוץ גילוי מכשיר: בחר את ערוץ FAM, HEX ו-CY5 עבור אות הפלואורסצנציה. עבור פלואורסצנציה ייחוסית NONE, אנא אל תבחר ROX.
5 ניתוח תוצאות (אנא עיין בהוראות הניסוי של כל מכשיר להגדרה)
לאחר התגובה, שמרו את התוצאות. לאחר הניתוח, התאימו את ערך ההתחלה, ערך הסיום וערך הסף של קו הבסיס בהתאם לתמונה (המשתמש יכול להתאים בהתאם למצב בפועל, ניתן להגדיר את ערך ההתחלה ל-3~15, ניתן להגדיר את ערך הסיום ל-5~20, כוונון) בגרף הלוגריתמי. בסף החלון, קו הסף נמצא בשלב לוגריתמי, ועקומת ההגברה של הבקרה השלילית היא קו ישר או מתחת לקו הסף).
6 בקרת איכות (בקרה פרוצדורלית כלולה בבדיקה) בקרה שלילית: אין עקומת הגברה ברורה עבור ערוצי גילוי FAM, HEX, CY5
בקרה חיובית של COV: עקומת הגברה ברורה של ערוצי גילוי FAM ו-HEX, ערך C≤32, אך ללא עקומת הגברה של ערוץ CY5;
יש לעמוד בדרישות הנ"ל בו זמנית באותו ניסוי; אחרת, הניסוי אינו תקין ויש לחזור עליו.
7 קביעת תוצאות.
7.1 אם אין עקומת הגברה או ערך Ct > 40 בערוצי FAM ו-HEX של דגימת הבדיקה, ויש עקומת הגברה בערוץ CY5, ניתן לשפוט שאין RNA של נגיף הקורונה החדש 2019 (2019-nCoV) בדגימה;
.2 אם לדגימת הבדיקה יש עקומות הגברה ברורות בערוצי FAM ו-HEX, וערך ה-Ct הוא ≤40, ניתן לשפוט שהדגימה חיובית לנגיף הקורונה החדש משנת 2019 (2019-nCoV).
7.3 אם לדגימת הבדיקה יש עקומת הגברה ברורה רק בערוץ אחד של FAM או HEX, וערך ה-Ct הוא ≤40, ואין עקומת הגברה בערוץ השני, יש לבדוק את התוצאות שוב. אם תוצאות הבדיקה החוזרת עקביות, ניתן לשפוט את הדגימה כחיובית עבור הבדיקה החדשה.
נגיף הקורונה 2019 (2019-nCoV). אם תוצאת הבדיקה החוזרת שלילית, ניתן לקבוע שהדגימה שלילית לנגיף הקורונה החדש 2019 (2019-nCoV).
ערך שיפוט חיובי
שיטת עקומת ROC משמשת לקביעת ערך CT הייחוס של הערכה וערך הייחוס של הבקרה הפנימית הוא 40.
פירוש תוצאות הבדיקה
1. יש לבדוק כל ניסוי עבור בקרות שליליות וחיוביות. ניתן לקבוע את תוצאות הבדיקה רק כאשר בקרות עומדות בדרישות בקרת האיכות.
2. כאשר ערוצי הגילוי FAM ו-HEX חיוביים, התוצאה מערוץ CY5 (ערוץ הבקרה הפנימי) עשויה להיות שלילית עקב תחרות במערכת.
3. כאשר תוצאת הבקרה הפנימית שלילית, אם ערוצי הגילוי FAM ו-HEX של מבחנה גם הם שליליים, פירוש הדבר שהמערכת מושבתת או שהפעולה שגויה, הבדיקה אינה חוקית. לכן, יש לבדוק את הדגימות שוב.
