מוצרים
ערכת זיהוי SARS-Cov-2-RT-PCR של Lifecosm עבור 2019-nCoV
שימוש צפוי
ערכה זו משמשת לזיהוי איכותי של נגיף קורונה חדש (2019-nCoV) באמצעות משטחי גרון, משטחי אף לוע, נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית, כיח. תוצאת הזיהוי של מוצר זה מיועדת רק להתייחסות קלינית, ואין להשתמש בו כיחידה עדויות לאבחון וטיפול קליני. מומלץ ניתוח מקיף של המצב בשילוב עם הביטויים הקליניים של המטופל ובדיקות מעבדה אחרות.
עקרון הבדיקה
הערכה מבוססת על טכנולוגיית RT-PCR חד-שלבית.למעשה, הגנים החדשים של נגיף הקורונה (2019-nCoV) ORF1ab ו-N משנת 2019 נבחרו כאזורי יעד ההגברה.פריימרים ובדיקות ניאון ספציפיות (גשושי גנים N מסומנים ב-FAM ובדיקות ORF1ab מסומנות ב-HEX) נועדו לזהות RNA מסוג חדש של נגיף הקורונה בשנת 2019 בדגימות.הערכה כוללת גם מערכת זיהוי בקרה פנימית אנדוגנית (בדיקה של גן בקרה פנימית המסומנת ב-CY5) לניטור תהליך איסוף הדגימות, הגברה של RNA ו-PCR, ובכך להפחית תוצאות שליליות כוזבות.
רכיבים עיקריים
| רכיבים | כרך（48T/ערכה） |
| פתרון תגובה RT-PCR | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan probemix（ORF1ab, N Gene, RNAseP Gene） | 864 µl |
| שליטה שלילית | 1500 µl |
| nCOV שליטה חיובית（l ORF1ab N Gene） | 1500 µl |
ריאגנטים משלו: ריאגנטים למיצוי RNA או טיהור.בקרה שלילית/חיובית: הבקרה החיובית היא RNA המכיל את קטע המטרה, בעוד שהבקרה השלילית היא מים ללא חומצות גרעין.במהלך השימוש, הם צריכים להשתתף בחילוץ ויש להתייחס אליהם כמדבקים.יש לטפל בהם ולהיפטר בהם בהתאם לתקנות הרלוונטיות.
גן ההתייחסות הפנימי הוא הגן האנושי RNAseP.
תנאי אחסון ותאריך תפוגה
-20±5℃, הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות יותר מ-5 פעמים, תקף ל-6 חודשים.
מכשיר ישים
עם FAM / HEX / CY5 ומכשיר PCR ניאון רב-ערוצי אחר.
דרישות דגימה
1. סוגי דגימות ישימים: משטחי גרון, משטחי אף-לוע, נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית, כיח.
2. איסוף דגימות (טכניקה אספטית)
ספוגית לוע: נגב את השקדים ואת דופן הלוע האחורי עם שני ספוגיות בו-זמנית, ולאחר מכן טבלו את ראש הספוגית במבחנה המכילה את תמיסת הדגימה
ליחה: לאחר שהמטופל סובל משיעול עמוק, אספו את הליחה שהשתעלו במבחנה עם מכסה ברגים המכילה את תמיסת הדגימה;נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית: דגימה על ידי אנשי מקצוע רפואיים.3.אחסון והובלה של דוגמאות
יש לבדוק דגימות לבידוד וירוסים ולבדיקת RNA בהקדם האפשרי.ניתן לאחסן דגימות שניתן לזהות תוך 24 שעות בטמפרטורה של 4℃;אלה שלא ניתן לזהות בתוך 24
שעות צריכות להיות מאוחסנות ב-70 ℃ או מתחת (אם אין מצב אחסון של 70 ℃, הן צריכות להיות
מאוחסן זמנית במקרר -20℃).על הדגימות להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות במהלך ההובלה.יש לשלוח דגימות למעבדה בהקדם האפשרי לאחר האיסוף.אם יש צורך להעביר דגימות למרחקים ארוכים, מומלץ אחסון קרח יבש.
שיטות בדיקה
1 עיבוד דגימה וחילוץ RNA (אזור עיבוד דגימה)
מומלץ לקחת 200μl של דגימה נוזלית למיצוי RNA.לשלבי מיצוי קשורים, עיין בהוראות של ערכות מיצוי RNA מסחריות.גם השלילי וגם השלילי
פקדים בערכה זו היו מעורבים בחילוץ.
2 הכנת מגיב PCR (אזור הכנת ריאגנטים)
2.1 הסר את כל הרכיבים מהערכה והפשר וערבב בטמפרטורת החדר.צנטריפוגה ב-8,000 סל"ד למשך מספר שניות לפני השימוש;חשב את הכמות הדרושה של ריאגנטים, ומערכת התגובה מוכנה כפי שמוצג בטבלה הבאה:
| רכיבים | מנה N (מערכת 25 µl) |
| nCOV primer TaqMan | 18 µl × N |
| פתרון תגובה RT-PCR | 2 μl × N |
| *N = מספר הדגימות שנבדקו + 1 (בקרה שלילית) + 1 (nCOVשליטה חיובית) | |
2.2 לאחר ערבוב יסודי של הרכיבים, צנטריפוגה למשך זמן קצר כדי לתת לכל הנוזל על דופן הצינור ליפול לתחתית הצינור, ולאחר מכן חלק את מערכת ההגברה של 20 µl לתוך צינור ה-PCR.
3 דגימות (אזור הכנת דגימה)
הוסף 5μl של הפקדים השליליים והחיוביים לאחר החילוץ.ה-RNA של הדגימה שתיבדק מתווסף לצינור התגובה של PCR.
מכסים את הצינור היטב וצנטריפוגה ב-8,000 סל"ד למשך מספר שניות לפני העברתו לאזור זיהוי ההגברה.
הגברה של 4 PCR (אזור זיהוי מוגבר)
4.1 הנח את צינור התגובה בתא המדגם של המכשיר, וקבע את הפרמטרים כדלקמן:
| שלב | מחזור מספר | טֶמפֶּרָטוּרָה(°C) | זְמַן | אוסףאֲתַר |
| לַהֲפוֹךתַעֲתוּק | 1 | 42 | 10 דק | - |
| טרום דנטורציהn | 1 | 95 | דקה 1 | - |
| מחזור | 45 | 95 | 15 שניות | - |
| 60 | שנות ה-30 | איסוף נתונים |
בחירת ערוץ זיהוי מכשירים: בחר את ערוץ FAM、HEX、CY5 עבור אות הקרינה.להתייחסות פלורסנט NONE, נא לא לבחור ROX.
5 ניתוח תוצאות (נא לעיין בהוראות הניסוי של כל מכשיר להגדרה)
לאחר התגובה, שמור את התוצאות.לאחר הניתוח, התאם את ערך ההתחלה, ערך הסיום וערך הסף של קו הבסיס בהתאם לתמונה (המשתמש יכול להתאים בהתאם למצב בפועל, ניתן להגדיר את ערך ההתחלה ל-3~15, ניתן להגדיר את ערך הסיום ל- 5~20, התאמה) בגרף הלוגריתמי בסף החלון, קו הסף נמצא בשלב הלוגריתמי, ועקומת ההגברה של הפקד השלילי היא קו ישר או מתחת לקו הסף).
6 בקרת קואוטי (בקרת פרוצדורלית כלולה בבדיקה) בקרה שלילית: אין עקומת הגברה ברורה עבור ערוצי זיהוי FAM, HEX, CY5n
בקרת COV חיובית: עקומת הגברה ברורה של ערוצי זיהוי FAM ו-HEX, ערך Ct≤32, אך ללא עקומת הגברה של ערוץ CY5;
יש לעמוד בדרישות הנ"ל בו-זמנית באותו ניסוי;אחרת, הניסוי אינו חוקי ויש לחזור עליו.
7 קביעת תוצאות.
7.1 אם אין עקומת הגברה או ערך Ct> 40 בערוצי FAM ו-HEX של מדגם הבדיקה, וקיימת עקומת הגברה בערוץ CY5, ניתן לשפוט שאין נגיף קורונה חדש 2019 (2019-nCoV) RNA בדגימה;
.2 אם לדגימת הבדיקה יש עקומות הגברה ברורות בערוצי FAM ו-HEX, וערך ה-Ct הוא ≤40, ניתן לשפוט שהדגימה חיובית לנגיף הקורונה החדש של 2019 (2019-nCoV).
7.3 אם לדגימת הבדיקה יש עקומת הגברה ברורה רק בערוץ אחד של FAM או HEX, וערך Ct הוא ≤40, ואין עקומת הגברה בערוץ השני, יש לבדוק את התוצאות מחדש.אם תוצאות הבדיקה החוזרת עקביות, ניתן לשפוט את המדגם כחיובי עבור החדש
וירוס קורונה 2019 (2019-nCoV).אם תוצאת הבדיקה החוזרת שלילית, ניתן לשפוט שהמדגם שלילי עבור נגיף הקורונה החדש לשנת 2019 (2019-nCoV).
ערך שיפוט חיובי
שיטת עקומת ROC משמשת לקביעת ערך ה-CT הייחוס של הערכה וערך הייחוס של הבקרה הפנימית הם 40.
פירוש תוצאות הבדיקה
1. כל ניסוי צריך להיבדק עבור בקרות שליליות וחיוביות.ניתן לקבוע תוצאות בדיקה רק כאשר בקרות עומדות בדרישות בקרת איכות
2.כאשר ערוצי זיהוי FAM ו-HEX חיוביים, התוצאה מערוץ CY5 (ערוץ בקרה פנימי) עשויה להיות שלילית עקב תחרות במערכת.
3. כאשר תוצאת הבקרה הפנימית שלילית, אם ערוצי זיהוי ה-FAM וה-HEX של המבחנה הם גם שליליים, , זה אומר שהמערכת מושבתת או שהפעולה שגויה, הבדיקה לא חוקית.לכן, יש לבצע בדיקה חוזרת של הדגימות.
